原标题:我国科学家开发新型蛋白质相互作用标记技术

2019年1月8日,北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心陈兴教授课题组在Nature
Chemical Biology
杂志在线发表了题为“Legionella effector SetA as a
general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins”(DOI:
10.1038/s41589-018-0189-y)的研究论文,报道通过化学酶法标记策略,实现了对嗜肺军团菌效应蛋白糖基转移酶SetA的蛋白底物鉴定,并阐明了SetA的底物选择机理,为糖蛋白的人工合成提供了一种有力的工具。

图. PUP-IT系统标记蛋白质相互作用原理示意图

糖基化修饰是一种广泛存在且重要的蛋白质翻译后修饰,由糖基转移酶催化形成。抗体、疫苗等许多临床治疗性蛋白质都具有特异性糖基化修饰,且对蛋白活性至关重要。基于糖基转移酶的化学酶法合成方法,是获得均一糖蛋白的有效手段之一。因此,寻找性质优良的各种糖基转移酶十分关键。对比真核细胞,细菌来源的糖基转移酶具有易表达纯化和催化产率高等优良性质,常被改造为人工合成糖蛋白的工具酶。然而,蛋白O-连接糖基化修饰在原核生物与真核生物之间并不保守,这成为了利用细菌糖基化系统生产真核生物O-糖蛋白的一大瓶颈。为了解决这个问题,陈兴教授课题组对病原菌-宿主相互作用中的蛋白质糖基化进行了探索。

在国家自然科学基金项目(项目编号:31570767、31670919)等资助下,上海科技大学庄敏/王皞鹏课题组合作开发出一种新型临近分子标记技术,研究成果以“A
Proximity-Tagging System to Identify Membrane Protein-Protein
Interactions”(鉴定膜蛋白相互作用的临近标记系统)为题,于2018年8月13日在线发表于国际著名期刊Nature
Methods(《自然·
技术》)。论文链接:

某些病原菌入侵宿主细胞后,会分泌具有糖基转移酶活性的效应蛋白。这些效应蛋白往往利用宿主的糖供体,并且修饰宿主的靶蛋白。因此,对这类糖基转移酶的工程化,可为实现真核生物O-糖蛋白的合成提供新的有效策略。嗜肺军团菌效应蛋白SetA具有O-葡萄糖转移酶活性,然而其底物蛋白尚未被鉴定。陈兴课题组首先开发了能够实现特异性标记和选择性富集的化学酶法策略。他们设计被SetA利用的生物正交基团修饰的糖供体(尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖,UDP-6AzGlc),将叠氮葡萄糖6AzGlc转移至底物蛋白。课题组通过点击化学反应,与可切割生物素探针连接,实现对底物蛋白的选择性富集和位点特异性质谱鉴定(下图)。质谱分析鉴定到分布于276个蛋白的317个O-glucose修饰位点。天然糖供体标记及军团菌侵染实验,验证了SetA可以修饰众多的底物蛋白。

细胞内的各种复杂生理活动、细胞对外界环境的反应,都以蛋白质之间的相互作用为纽带,形成复杂信号转导网络系统。蛋白质相互作用包括形成较稳定的蛋白质复合物或瞬时相互作用两类。一些蛋白质之间的瞬时相互作用有重要的生理功能,但是由于比较微弱,常规方法难以检测。近年来,临近标记技术正在被逐渐应用到蛋白质相互作用的研究中。其原理是在已知蛋白上融合一个具有临近标记功能的酶,通过酶介导的蛋白质共价修饰将与已知蛋白相互作用的蛋白标记上生物素,从而使原本不易被检测的相互作用蛋白被发现和鉴定。但是目前临近标记技术常用的两个酶都有比较大的局限性:BioID方法应用的biotin
ligase(生物素连接酶)突变体的活性不够高,而APEX方法应用的peroxidase(过氧化酶)需要在反应体系里添加过氧化氢。

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庄敏和王皞鹏课题组合作开发了一种不同于BioID和APEX的新型邻近标记技术,命名为PUP-IT
(Pupylation-based interaction
tagging)。PUP-IT利用了细菌中的Pup连接酶PafA,通过将邻近蛋白标记上小分子蛋白Pup来实现对蛋白质相互作用的捕捉。Pup系统不但能对临近蛋白进行标记,而且能够捕捉到蛋白质之间微弱的相互作用。他们将PUP-IT系统应用到T细胞表面受体CD28的研究中,鉴定到了多个已知与CD28相互作用的蛋白,并且发现了大量潜在的未报道的CD28相互作用蛋白。

 

与BioID和APEX等传统的临近标记技术相比,PUP-IT技术有一定的优势。首先,PUP技术的底物分子不容易从酶上脱落,从而降低了标记的背景噪声;另外由于PUP-IT的底物是小分子蛋白,因此更容易被应用到组织或动物上,于在体水平(in
vivo)鉴定和检测蛋白质相互作用。

化学酶法标记策略流程示意图

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